Prvi inzulini
Krajem 1922. počinje industrijska proizvodnja inzulina te ga uz sveučilište u Torontu počinju proizvoditi i tvrtke Eli Lilly čiji se inzulin Iletin prvi pojavio na tržištu (slika 2), te danski Nordisk Insulinlaboratorium (današnji Novo Nordisk). Supruga osnivatelja Nordiska, Marie Krogh, imala je dijabetes, te je bila među prvim pacijentima doktora Bantinga. Ove dvije tvrtke i danas su vodeće u svijetu u proizvodnji inzulina (Eli Lilly – humalog i humulin, Novo Nordisk – novorapid, fiasp, tresiba, levemir).
Slika 2. Inzulin Iletin (izvor)
Gotovo punih 80 godina jedini dostupni inzulin bio je životinjskog podrijetla i to svinjski i goveđi. Kako životinjski inzulini nisu u početku bili potpuno pročišćeni, a i dijelom se, na molekularnoj razini, razlikuju po strukturi od ljudskog inzulina, pacijentima su se znale pojavljivati alergijske reakcije pa čak i rezistencija što bi znatno otežavalo liječenje šećerne bolesti. Određen problem predstavljalo je i nabavljanje velikih količina životinjskih gušterača od kojih bi se dobile male doze inzulina za sve dijabetičare kojima je potreban. Bilo je potrebno dvije tone svinjskih gušterača da bi se proizvelo svega 225 grama inzulina u prahu.
U Hrvatskoj se inzulin počeo proizvoditi od 1939. godine u Zagrebu u Odjelu za biološke proizvode Zavoda PLIBAH (današnja PLIVA).
Bio je to prvi inzulin proizveden u jugoistočnom dijelu Europe.
Nordisk, 1950. godine, stavlja na tržište inzulin NPH (Neutral Protamine Hagedorn) generičkog naziva izofan koji ima produženo djelovanje (sporije apsorbiranje). To je mutna mješavina kristaliziranog proteina protamina i inzulina brzog djelovanja. Na ovaj način dijabetičarima diljem svijeta bilo je omogućeno reducirati broj svakodnevnih ubrizgavanja inzulina zbog njegovog dužeg djelovanja.
Tvrtka Novo, 1953. godine, izbacuje na tržište liniju Lente inzulina sa produženim djelovanjem (Lente, Semilente, Ultralente). Ta linija sadrži cink koji sa inzulinom tvori heksamerne strukture. Takve strukture u krvotoku nemaju djelovanje ali nisu ni stabilne. Kako se heksamerne strukture polako raspadaju u biološki aktivne monomerne tako inzulin u krvotoku produžuje vrijeme djelovanja na stanice.
Biokemija inzulina
Napreci na području znanosti stvarali su preduvjete da se u budućnosti kod liječenja dijabetesa počne primjenjivati i ljudski inzulin. Američko-britanski par Watson i Crick otkrili su, 1953. godine, strukturu biološki najvažnije molekule deoksiribonukleinske kiseline (DNA) koja je odgovorna za proizvodnju svih proteina u našem organizmu pa tako i inzulina. Proteini u organizmu nastaju prepisivanjem i prevođenjem informacije sa DNA putem posebnih bioloških mehanizama. Područja na DNA koja su odgovorna za nastajanje proteina zovu se geni, a gen koji kodira za inzulin kod čovjeka nalazi se na vrhu 11. kromosoma.
Inzulin kao molekula proteina sastoji se od dvaju (alfa i beta) lanaca aminokiselina povezanih preko atoma sumpora vezama zvanim disulfidni mostovi (slika 3). Alfa lanac građen je od niza kojeg čini 21 aminokiselina, a beta lanac sadrži 30 aminokiselina. Dakle ukupno 51 aminokiselina u molekuli inzulina. U prirodi postoji samo 20 različitih aminokiselina i one tvore sve proteine u živim organizmima. Aminokiselinski niz u svakoj vrsti proteina je strogo specifičan i zaslužan je za njegovu trodimenzionalnu strukturu, a posljedično i za biološku aktivnost u organizmu.
Točan raspored aminokiselina u inzulinu prvi je ustanovio britanski znanstvenik Frederick Sanger, 1955. godine, za što je dobio Nobelovu nagradu. On je goveđi inzulin tretirao određenim enzimima koji kidaju lanac aminokiselina na točno određenom mjestu. Nad dobivenim fragmentima je primijenio kromatografsku metodu, odnosno promatrao je njihovo kretanje po filter papiru na temelju njihove razlike u električnom naboju i topljivosti u otapalu. Fragmente je na kraju poredao po veličini i dobio aminokiselinski niz inzulina. Osim što je ovim otkrio strukturu inzulina, dokazao je da su proteini građeni od niza molekula aminokiselina.
Slika 3. Primarna struktura humanog inzulina
Humani inzulini
Na temelju poznatog aminokiselinskog niza proteina inzulina, odnosno njegove primarne strukture, 1963. godine u laboratoriju je sintetiziran prvi humani inzulin. To su simultano napravili čak dvojica istraživača neovisno jedan o drugome. Panayotis Katsoyannis u Pittsburghu i Helmut Zahn u Aachenu u Njemačkoj. Sinteza ovakvog inzulina nije odmah otvorila vrata masovnoj proizvodnji, ali je dala prostor za daljnja istraživanja na razvoju proizvodnje inzulina.
Mlada tvrtka Genentech je u suradnji sa medicinskim centrom City of Hope u Kaliforniji 1978. godine proizvela prvi genetski sintetički humani inzulin. Ovdje je riječ o samim počecima genetskog inženjeringa, odnosno tehnologiji rekombinantne DNA. To je tehnologija kod koje se točno određeni gen jednog organizma integrira sa genomom drugog organizma koji tada započinje ekspresiju umetnutog stranog gena tj. sintezu njegovog proteina. Organizam koji su koristili za proizvodnju inzulina je, ni više ni manje nego bakterija zvana Escherichia coli. To je bakterija koja uobičajeno živi u našem probavnom traktu, ali šira populacija ju najbolje upozna kad im priredi urogenitalne infekcije. In vitro sintetizirani ljudski gen za proizvodnju inzulina ubacili su u malenu kružnu molekulu DNA, zvanu plazmid, koja se nalazi u bakteriji E. coli. Znanstvenici su ugradili gen za alfa i gen za beta lanac u odvojene bakterije. Sada bakterije proizvode alfa i beta lance inzulina kao da je prirodno njen protein. Kad Esherichia izluči dovoljno produkta on se sakuplja te se inzulinski lanci izoliraju i pročišćavaju posebnim tehnikama i na kraju spajaju sumpornim vezama. Tako dobivamo njegov aktivni oblik koji je istovjetan onom proizvedenom u ljudskom tijelu.
Genentech, u suradnji sa tvrtkom Eli Lilly, počinje masovnu proizvodnju prvog humanog inzulina pod nazivom Humulin kojeg je, 1982. godine, odobrila američka agencija za hranu i lijekove FDA.
Inzulin je bio ujedno i prvi biotehnološki proizvod koji je dobio dozvolu za primjenu u medicini.
Uz tvrtku Eli Lilly, genetskim inženjeringom u proizvodnji inzulina bavi se i današnji Novo Nordisk koji za proizvodnju inzulina ne koristi bakteriju E. coli, već kvaščevu gljivicu (Saccharomyces cerevisiae) poznatu i kao glavni sastojak pekarskog kvasca. Tvrtka Novo konvertira svinjski inzulin u humani polusintetski inzulin Actrapid od 1983. godine pomoću kemikalija i enzima promjenom jedne aminokiseline, a uz pomoć kvaščeve gljivice proizvode humani inzulin od 1987. godine. Danske tvrtke Novo i Nordisk ujedinjuju se 1989. godine u jedinstveni Novo Nordisk. Hrvatska tvrtka Pliva ne zaostaje ni malo u ponudi najmodernijih inzulina svojim pacijentima te u suradnji s Novo Nordiskom stavlja na tržište humane inzuline Homorap, Homolong i Homofan kratkog i srednjedugog djelovanja.
Humani analozi
Tijekom devedesetih godina 20. stoljeća, genetski inženjering nam je omogućio novu generaciju humanih inzulina, takozvanih modernih inzulina. Riječ je o humanim inzulinskim analozima. To su inzulini kojima su iz prirodne proteinske strukture određene aminokiseline zamijenjene nekim drugim aminokiselinama. Na ovaj način dobili smo malo drugačiji inzulin, inzulin koji se razlikuje od originalnog humanog u određenim svojstvima kao što su struktura, metabolička aktivnost kao npr. brzina apsorpcije, odnosno brzina spuštanja šećera u krvi (slika 4). Prvi takav inzulin, koji je 1996. godine došao u medicinsku upotrebu, proizveden je u tvornici Ely Lilly and Company. Njegovo komercijalno ime je Humalog i od humanog inzulina se razlikuje u tome što mu je zamijenjen redoslijed dviju aminokiselina na beta lancu. Aminokiseline lizin i prolin nalaze se na 28. i 29. mjestu u nizu umjesto na 29. i 28. kao kod humanih inzulina. Po njima ovaj inzulin nosi svoj generički naziv lispro inzulin. Prvi Novo Nordiskov analogni inzulin je NovoRapid, prvi put primijenjen u medicini 1999. godine. Aminokiselina prolin mu je zamijenjena asparaginom pa mu otud ime aspart inzulin. Godine 2004. na tržište nam dolazi inzulin Apidra kojeg proizvodi tvrtka Sanofi. Njegovo generičko ime je glulizin po lizinu i glutaminu koji su zamijenili mjesta sa dvije aminokiseline iz prirodne strukture inzulina. Ova tri inzulina su brzodjelujuća, jer promjene u strukturi aminokiselinskog lanca ne dopuštaju inzulinu povezivanje u dimerne i heksamerne tvorbe, već se posljedično tome brže apsorbira u krvotok. Zato su ovi inzulini prandijalni, odnosno koriste se uz obroke. Trenutno vrlo popularan najnoviji brzodjelujući inzulin je Fiasp (Fast-acting Insulin ASPart) koji nije ništa drugo nego NovoRapid sa dodatkom vitamina B3 koji dodatno pripomaže bržoj apsorpciji u krvotok.
Slika 4. Analozi inzulina (izvor)
Osim ovih brzodjelujućih inzulina imamo i analogne dugodjelujuće inzuline. Prvi analogni humani dugodjelujući inzulin Lantus se pojavio 2000. godine, a njega nasljeđuje poboljšana verzija Toujeo, 2015. godine. Proizvela ih je francuska tvrtka Sanofi. Generičko ime im je glargin po zamijenjenom glicinu na alfa i dodana dva arginina na kraju beta lanca. Ostale dugodjelujuće inzuline proizvodi Novo Nordisk. Levemir (detemir) je na tržištu od 2005., a Tresiba (degludec) od 2016. Oba inzulina imaju na kraju beta lanca dodane duge ugljikovodične kiseline (Levemir miristinsku, a Tresiba palmitinsku kiselinu). Sve te dodane strukture na ovim inzulinima omogućavaju formiranje inzulinskih poliheksamernih struktura što rezultira sporom apsorpcijom i dužom prisutnošću u krvi, a time i njegovo duže djelovanje. Zbog toga se uzimaju jednom dnevno, te pokrivaju bazalne potrebe metabolizma za inzulinom.
Pametni inzulini (smart insulins)
Sljedeća generacija inzulina su pametni ili smart inzulini. Obećavajući inzulini, koje svi dijabetičari s nestrpljenjem iščekuju, još se nisu našli u upotrebi, ali na tome se intenzivno radi i trenutno su u fazi testiranja. Njihova primjena trebala bi napraviti još jedan veliki korak u modernizaciji liječenja dijabetesa. Pametni inzulin, jednom injektiran, trebao bi se apsorbirati po potrebi i tako zadržavati razinu glukoze u krvi konstantnom, u granicama normalnih vrijednosti. Inzulin koji se aktivira samo onda kada raste razina šećera u krvi i deaktivira kada je razina šećera u granicama normale, uvelike bi olakšao regulaciju dijabetesa. Ubrizgan u tijelo nalazio bi se u neaktivnom „slijepljenom“ obliku te bi ga molekule glukoze kod povećane koncentracije lagano odvajale uzrokujući njegovu biološku aktivnost, tj. dovođenje razine šećera do normalnih granica gdje opet ostaje samo neaktivan oblik inzulina. Više ne bi bilo potrebno tako često kontrolirati šećer u krvi niti bockati se svakodnevno kako bismo uzeli inzulin, a i računanje ugljikohidrata bila bi stvar prošlosti. S ovakvim inzulinima hipoglikemije i hiperglikemije, također, više ne bi bile problemi koji nam zadaju glavobolju, već samo uspomena na neka prošla vremena.
Do pojave ovakvih inzulina u općoj upotrebi proći će, vjerojatno, još neko vrijeme. Do tada nam jedino preostaje čuvati zdravlje i koristiti dostupne inzuline što bolje možemo. Kako god bilo na kraju, inzulin će i dalje ostati kamen temeljac kada je regulacija dijabetesa u pitanju.
Autor: Marin Mandić
Povijest inzulina (1. dio) možete pronaći ovdje.
p.s. Svakako pogledajte odličan video povodom 100 godišnjice inzulina:
